ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΙIΙ
ΒΑΣΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ
- Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί το τρίτο βασικό βήμα για την μετέπειτα μελέτη του DNA και την γονοτύπηση.
- Το πρωτόκολλο της παρούσας εργαστηριακής άσκησης είναι απόλυτα προσαρμοσμένο για την πραγματοποίηση του από μαθητές και στο πλαίσιο του σχολικού περιβάλλοντος.
- Όλα τα υλικά που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια της άσκησης είναι πλήρως ασφαλή για χρήση αυτών από μαθητές και στο πλαίσιο του σχολικού περιβάλλοντος.
- Μέση διάρκεια της εργαστηριακής άσκησης «Ηλεκτροφόρηση» είναι 30min.
- Τονίζεται η σημασία της λεπτομέρειας κατά τη μετάγγιση των μικροποσοτήτων για μία επιτυχημένη ηλεκτροφόρηση.
- Τονίζεται η σημασία του αρνητικού μάρτυρα και σε τι διαφέρει από ένα προς ανάλυση δείγμα ενδιαφέροντος.
Προετοιμασία εργαστηριακής άσκησης
- Πιπέπες Pasteur/πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου τύπου Gilson
- Φυγόκεντρος
- Συσκευή ηλεκτροφόρησης
- Αυτοπωματιζόμενα σωληνάρια τύπου Eppendorf 0,5ml και 1,5ml
- Ακρορύγχια κατάλληλα για τις πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου διαφορετικού εύρους
- Εστία θερμότητας
- Αγαρόζη
- Ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x (Tris-acetate-EDTA)
- Γλυκερόλη με χρωστική (Orange G)
- Μάρτυρας μοριακών μεγεθών
- Χρωστική τύπου Midori Green/Xpert Green/GelRed
Εργαστηριακή πορεία
- Προετοιμασία του πηκτώματος αγαρόζης (διάλυση σκόνης αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x με τη βοήθεια θερμότητας)
- Κατόπιν σχηματισμού του πηκτώματος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, είναι έτοιμο προς χρήση
- Καλή ανάμιξη των PCR προιόντων (δείγμα ΧΧ και αρνητικός μάρτυρας ΧΧ) με την Orange G
- Προσεχτική εναπόθεση των ποσοτήτων στα σχηματιζόμενα πηγαδάκια του πηκτώματος
- Εναρξη λειτουργίας της συσκευής ηλεκτροφόρησης και εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου για 30min
- Τερματισμός της λειτουργίας της συσκευής και παρατήρηση του πηκτώματος στην τράπεζα οπτικοποίησης της συσκευής
Ερωτήσεις
- Ποιος ο ρόλος του κάθε αντιδραστηρίου;
- Αν προσθέσω λίγο παραπάνω από το PCR προιόν ποια μπορεί να είναι τα πιθανά αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης;
- Ποιος ο ρόλος του αρνητικού μάρτυρα και τι περιμένω να δω στη θέση που έγινε η εναπόθεσή του;