ΠΕΨΗ ΜΕ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΟ
ΕΝΖΥΜΟ
ΕΝΖΥΜΟ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΙV
ΒΑΣΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ
- Η πέψη με περιοριστικό ένζυμο αποτελεί το τέταρτο βασικό βήμα για την μετέπειτα μελέτη του DNA και την γονοτύπηση.
- Το πρωτόκολλο της παρούσας εργαστηριακής άσκησης είναι απόλυτα προσαρμοσμένο για την πραγματοποίηση του από μαθητές και στο πλαίσιο του σχολικού περιβάλλοντος.
- Όλα τα υλικά που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια της άσκησης είναι πλήρως ασφαλή για χρήση αυτών από μαθητές και στο πλαίσιο του σχολικού περιβάλλοντος.
- Μέση διάρκεια της εργαστηριακής άσκησης «Πέψη με περιοριστικό ένζυμο» είναι 45min.
- Τονίζεται η σημασία της λεπτομέρειας κατά τη μετάγγιση των μικροποσοτήτων για μία επιτυχημένη ηλεκτροφόρηση.
- Τονίζεται η σημασία της εκ των προτέρων γνώσης της θέσης περιορισμού του ενζύμου και ποια τα αναμενόμενα θραύσματα σε κάθε περίπτωση.
Προετοιμασία εργαστηριακής άσκησης
- Πιπέπες Pasteur/πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου τύπου Gilson
- Φυγόκεντρος
- Συσκευή PCR
- Συσκευή ηλεκτροφόρησης
- Αυτοπωματιζόμενα σωληνάρια τύπου Eppendorf 0,5ml και 1,5ml
- Ακρορύγχια κατάλληλα για τις πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου διαφορετικού εύρους
- Εστία θερμότητας
- Αγαρόζη
- Ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x (Tris-acetate-EDTA)
- Γλυκερόλη με χρωστική (Orange G)
- Μάρτυρας μοριακών μεγεθών
- Χρωστική τύπου Midori Green/Xpert Green/GelRed
- Περιοριστικό ένζυμο Fnu4HI και το ρυθμιστικό του διάλυμα
- H2O
Εργαστηριακή πορεία
- Προετοιμασία των προϊόντων πέψης με ανάμιξη PCR προϊόντος (εργαστηριακή πρακτική ΙΙ) με 0,1μL Fnu4HI και κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος και H2O μέχρι τελικό όγκο αντίδρασης 15μL
- Εναπόθεση των προϊόντων προς πέψη στη μεταλλική θερμαντική πλάκα τη συσκευής PCR (37ο C για 15min)
- Προετοιμασία του πηκτώματος αγαρόζης (διάλυση σκόνης αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x με τη βοήθεια θερμότητας)
- Κατόπιν σχηματισμού του πηκτώματος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, είναι έτοιμο προς χρήση
- Καλή ανάμιξη των προϊόντων πέψης (δείγμα ΧΧ και αρνητικός μάρτυρας ΧΧ) με την Orange G
- Προσεχτική εναπόθεση των ποσοτήτων στα σχηματιζόμενα πηγαδάκια του πηκτώματος
- Έναρξη λειτουργίας της συσκευής ηλεκτροφόρησης και εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου για 45min
- Τερματισμός της λειτουργίας της συσκευής και παρατήρηση του πηκτώματος στην τράπεζα οπτικοποίησης της συσκευής
Ερωτήσεις
- Ποιος ο ρόλος του κάθε αντιδραστηρίου;
- Αν προσθέσω λίγο παραπάνω από το PCR προϊόν στην πέψη ποια μπορεί να είναι τα πιθανά αποτελέσματα της πέψης;
- Αν προσθέσω λίγο παραπάνω από το προϊόν πέψης στην ηλεκτροφόρηση ποια μπορεί να είναι τα πιθανά αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης;
- Ποιος ο ρόλος του αρνητικού μάρτυρα και τι περιμένω να δω στη θέση που έγινε η εναπόθεσή του;